Guido Reni nació el 4 de noviembre de 1575 en la ciudad de Bolonia, en el seno de una familia vinculada a las artes. Su padre, Daniele Reni, ejercía como músico y cantante en la capilla del palazzo comunal, mientras que su madre, Ginevra Pozzi, se encargaba del entorno doméstico. A la edad de nueve años, en 1584, ingresó formalmente como aprendiz en el taller del pintor flamenco Denis Calvaert, instalado en Bolonia. Allí coincidió con otros jóvenes estudiantes como Francesco Albani y Domenico Zampieri, conocido posteriormente como el Domenichino. Durante este periodo inicial de formación, que se extendió por una década, Reni adquirió nociones esenciales de dibujo, perspectiva y preparación de pigmentos. La muerte de su padre en 1594 alteró la estructura económica de su hogar, obligándolo a asumir responsabilidades financieras inmediatas como cabeza de familia.
Hacia 1594 o 1595, Guido Reni abandonó el taller de Denis Calvaert para ingresar en la Accademia degli Incamminati, bajo la dirección de los Carracci. En esta etapa inicial ejecutó la Coronación de la Virgen con los santos Juan Evangelista, Juan Bautista, Bernardo y Catalina de Alejandría para la iglesia de San Bernardo de Bolonia, una obra que actualmente se conserva en la Pinacoteca Nazionale de dicha ciudad. Su reconocimiento público en la región se consolidó en 1598 con motivo de la visita del papa Clemente VIII a Bolonia; Reni participó en el diseño de las decoraciones efímeras para el recibimiento pontificio y se le confió la ejecución de pinturas murales en la fachada del Palazzo del Reggimento, un encargo que acrecentó su prestigio entre los comitentes locales.
El 5 de diciembre de 1599, el pintor fue elegido miembro del consejo de la corporación del Arte dei Pittori de Bolonia. Durante este periodo se formalizaron las tensiones profesionales con Ludovico Carracci, motivadas por la rivalidad en el mercado local y la tasación de las piezas. Entre los encargos de este momento de transición destaca la Aparición de la Virgen con el Niño a San Jacinto, destinada a la iglesia de San Mattia en Bolonia, una obra hoy desaparecida de la cual solo restan testimonios gráficos y documentación contractual. Estas crecientes disputas con el entorno de los Carracci y la búsqueda de nuevos canales de patrocinio llevaron a Reni a desvincularse de las estructuras institucionales boloñesas y trasladarse a Roma hacia 1601, viaje que realizó en compañía del pintor Francesco Albani.
A su llegada a Roma a finales de 1601, Reni obtuvo el patrocinio inmediato del cardenal Paolo Emilio Sfondrati, sobrino del fallecido papa Gregorio XIV. Sfondrati le asignó alojamiento y le encomendó una serie de trabajos vinculados a la basílica de Santa Cecilia en Trastevere, que incluían las pinturas del Martirio de la santa y Santa Cecilia con el ángel (habiendo ejecutado previamente para este mismo comitente la copia del Éxtasis de Santa Cecilia de Rafael destinada a Bolonia). Durante este primer periodo romano, Reni alquiló un taller independiente y comenzó a recibir encargos de la familia Aldobrandini. En 1604, el cardenal Pietro Aldobrandini le contrató para pintar la "Crucifixión de San Pedro" destinada a la abadía de las Tres Fontanas, un encargo que desató tensiones directas con Michelangelo Merisi da Caravaggio, quien —según las crónicas de la época— amenazó físicamente a Reni al considerar que este estaba adoptando sus soluciones técnicas de iluminación. La elección de Reni por parte de los comitentes papales incrementó la rivalidad en el mercado romano.
En 1605, con la elección del papa Paulo V, de la familia Borghese, el estatus financiero de Reni se consolidó significativamente gracias a la mediación del cardenal nepote Scipione Borghese. Entre 1608 y 1609, el pontífice le confió la decoración al fresco de las bóvedas de las habitaciones papales en los Palacios Vaticanos: la Sala de Sansón y la Sala de los Decretos (conocida actualmente como Sala de las Bodas de Aldobrandini), recibiendo pagos mensuales registrados en la tesorería papal. Inmediatamente después, se le asignó la decoración del Oratorio de San Andrés, del papa San Gregorio Magno. En 1609, Reni asumió la dirección de los frescos de la Capilla de la Anunciación en el Palacio del Quirinal, coordinando a un equipo de asistentes que incluía a Giovanni Lanfranco y Francesco Albani. Sin embargo, este gran proyecto público generó disputas agudas entre el pintor y el tesorero papal debido a retrasos en los pagos de los estipendios y desacuerdos sobre el valor material de su trabajo. Exasperado por estas trabas burocráticas y financieras, Reni abandonó Roma súmitamente en 1611 para refugiarse en Bolonia, donde permaneció hasta su regreso a la corte papal tras largas negociaciones mediadas por los Borghese. Reni retornó a Roma hacia 1612 bajo un contrato específico que garantizaba sus exigencias económicas. Este acuerdo financiero fructificó en la ejecución de su fresco más célebre en la ciudad, La Aurora, pintado en el techo del casino de la residencia del cardenal Scipione Borghese (hoy Palazzo Pallavicini-Rospigliosi), concluido formalmente en 1614. Una vez saldados los compromisos financieros y contractuales de este proyecto, Reni abandonó Roma de manera definitiva en el verano de ese mismo año para fijar su residencia permanente en Bolonia.
Establecido de nuevo en Bolonia en 1614, Reni adquirió una propiedad inmueble y organizó un taller de grandes dimensiones en la Via de' Coltelli para absorber la demanda de encargos provenientes de toda Europa. La estructura de su taller funcionaba bajo un régimen estricto de producción donde los ayudantes preparaban los lienzos y ejecutaban las fases iniciales basándose en los dibujos del maestro.
En 1616, el Senado de Bolonia le encargó una obra pública de gran formato, la "Pietà dei Mendicanti", destinada al altar mayor de la iglesia de Santa Maria de' Mendicanti, un proyecto financiado con fondos municipales como muestra de prestigio cívico. Su éxito institucional atrajo la atención de cortes extranjeras; en 1617, el duque Ferdinando Gonzaga le invitó a Mantua para decorar los apartamentos del Palacio Ducal, pero Reni rechazó prolongar su estancia debido a desavenencias con el protocolo cortesano y los pagos retrasados. Su actividad financiera se diversificó mediante el cobro de elevadas sumas por adelantado, una práctica que causó litigios con diversos clientes.
En 1621, el pintor aceptó un contrato para trasladarse a Nápoles con el fin de decorar la capilla del Tesoro de San Jenaro en la catedral. Su estancia en territorio napolitano fue breve y accidentada: la facción local de artistas, encabezada por Belisario Corenzio, proferió amenazas de muerte contra Reni y agredió físicamente a su sirviente, lo que obligó al pintor a huir de la ciudad de forma inmediata y regresar a Bolonia sin cumplir los términos del acuerdo. De regreso en su ciudad, su adicción a los juegos de azar, particularmente a juegos de cartas como la primiera, comenzó a manifestarse de forma severa, afectando su flujo de caja personal.
A pesar de los ingresos sustanciales obtenidos por encargos de la corona española y de otros destacados mecenas europeos —período al que pertenece el gran óleo de "Atalanta e Hipómenes"—, las deudas acumuladas en las mesas de juego le obligaban a aceptar múltiples anticipos en efectivo de manera simultánea. En 1625 completó el gran lienzo de la Santísima Trinidad para la iglesia de la Trinità dei Pellegrini en Roma, viajando brevemente a dicha ciudad durante el Año Santo para supervisar su instalación física; allí fue recibido con honores por el papa Urbano VIII y la corte Barberini, quienes buscaron asegurar su permanencia en la ciudad. Hacia 1627, la gestión de su taller experimentó tensiones内部s causadas por la deserción de algunos de sus discípulos más dotados, como Francesco Gessi y Giovanni Giacomo Sementi, quienes decidieron abrir talleres independientes en Bolonia, compitiendo directamente por las mismas cuotas del mercado local.
La irrupción de la epidemia de peste en Bolonia durante el año 1630 alteró profundamente la rutina de su taller y la disponibilidad de materiales. Ante la crisis sanitaria, las autoridades municipales le encomendaron la realización del Pallione del Voto, un estandarte de seda procesional pintado en 1631 como ofrenda cívica para implorar el fin de la enfermedad, obra por la cual recibió una compensación económica directa del erario público. Durante esta década de 1630, la ludopatía de Reni alcanzó niveles críticos, sumergiéndolo en una crisis financiera permanente de la que no logró recuperarse. Para saldar las deudas de juego con prestamistas y acreedores en Bolonia, el pintor modificó el modelo de producción de su taller: comenzó a despachar obras con extrema rapidez bajo un sistema de tarificación por horas (a ora), delegando la preparación de fondos y copias en sus asistentes para luego aplicar únicamente retoques finales y su firma, lo que mermó la cotización de sus piezas en el mercado local.
Los litigios judiciales por incumplimiento de contratos se multiplicaron; diversos mecenas, entre ellos representantes de la corte de Francia y nobles genoveses, reclamaron la devolución de los adelantos monetarios en efectivo ante la falta de entrega de los cuadros prometidos. A pesar de la precariedad económica, Reni continuó residiendo en Bolonia manteniendo un aislamiento social creciente, rompiendo relaciones con antiguos amigos y restringiendo el acceso a su vivienda a unos pocos sirvientes y acreedores que controlaban su producción diaria. En los meses iniciales de 1642, su estado de salud física decayó sensiblemente debido a episodios recurrentes de fiebres persistentes y dolencias gástricas. A finales de julio de ese año quedó confinado definitivamente en su cama, perdiendo la capacidad de trabajar y dictar instrucciones a su taller, el cual albergaba numerosos lienzos inacabados.
Guido Reni falleció en Bolonia el 18 de agosto de 1642 a la edad de sesenta y seis años. Su cuerpo fue trasladado a la Basílica de San Domenico, donde recibió sepultura en la capilla del Rosario; este espacio funerario sería compartido décadas más tarde, en 1665, con los restos de la célebre pintora boloñesa Elisabetta Sirani, hija de su principal discípulo. Su trayectoria vital concluyó de este modo dejando un taller colmado de deudas e inventarios por liquidar para sus herederos legales.